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CRISPR操作指南-gRNA设计教程

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我们都知道一个基因(一个基因ID)往往可以编码多个转录本(多个NM号),相应的也对应多个蛋白质(多个NP号)。一条mRNA上编码蛋白质的区域称为CDS(coding sequence)。一个基因产生的多个mRNA往往有部分区域是重叠的(图4a红框内的区域),这部分重叠的区域叫做保守的CDS(consensusCDS),简称CCDS。我们通过基因组编辑破坏一个基因,往往需要破坏所有的mRNA编码的蛋白,因此,我们选择编辑的位点通常位于CCDS区域的上游位置(靠近起始密码子ATG的位置)。编辑的目的是在CDS区域随机引入碱基的缺失或插入(indels),如此可以破坏三联密码子的阅读框,产生移码突变(图4b)。




CCDS和移码突变示意图。a,方框代表外显子组织情况,黑色方框代表CDS区,红色框内是该基因对应的CCDS;b,移码突变。一个T碱基的插入改变了阅读框,最终导致终止密码子的提前出现,蛋白质翻译提前终止。移码突变往往导致蛋白质功能丧失。



SgRNA设计的站点介绍如下:




一、首先着重介绍几个在线设计gRNA的工具





这个在线站点功能非常丰富,可以选择基因编辑工具的其他用途(激活,抑制基因表达等)(图1-1)。下一步就是选择物种(图1-2)。但只有常见的9种。再下一步就是直接输入基因的名称(或序列)即可(图1-3)。



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图1-1 选择编辑类型



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图1-2 选择物种



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图1-3 选择基因名称。



但是出来的sgRNA位置有一些并不总在ATG的下游(图2所示,1,2,6,9,12,16,22几条sgRNA位于ATG的上游)。所以根据位置,对于做基因的敲除(KO)而言,强烈建议选择ATG下游通常100 aa以内范围内的sgRNA来用(比如图3中的35710等较下游的);而且,一定要位于CCDS区域内(CCDSconsensus CDS,即公共的CDS区域,是针对很多个转录本[isoforms]定义,图2中路色条框即是。这个很重要!!!)。



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图2



●   Feng Zhang lab:http://crispr.mit.edu/


这是最早的一个设计站点。包括常见的16个物种。选中物种,把你要设计的区段序列扔到下面的框里运行就行。。但前提是你自己已经选好了位置(图3)


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图3





这个站点内容更加丰富,比如物种覆盖式最多的,包括植物,昆虫等等(图4左)。这个站点也是输入目的基因的序列定制的,不同的是可以有较大的自由度选择位置预测。



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图4


  • 还有一些商业公司的,比如Thermo下面的(图5):

https://apps.thermofisher.com/crispr/index.html#/search


物种较少,商业性目的特别强,了解下即可。



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图5



  • 其实你只要google一下会发现特别多的设计工具,感兴趣的可以自行探索。


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图6



二、手动版设计方法—好用不贵


手动版本虽然费事,但有时候却会事半功倍,节约后续鉴定单克隆的成本。我们举例来说:



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图7



序列中PAM和sgRNA的序列放大如下(前提是sgRNA位于CCDS区域,而且特异性要保证):


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图8



也即我常说的,让Cas9切割位置(确定的)跨过一个酶切位点(比如sfcI)(在前两篇文章中都有所提及)。这样,Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候,酶切位点一定会遭到破坏这为后续的单克隆鉴定提供了便利。请看示意图(图9):



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图9



注意一点:PCR引物设计的时候确保PCR片段内部不要出现第二个SfcI的酶切位点。这样后面酶切的时候结果是唯一的。实验流程和鉴定结果应该是这样的(图10):




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图10



对于WT,酶切是充分的,不会残留。而对于成功编辑的两个mixture:*1和*2,由于产生了indels,部分sfcI的位点造到破坏,sfcI切不动的。对于成功编辑的单克隆而言,应该是一点都切不动。后续鉴定只要这样的克隆去测序即可(图11,红色编号为阳性克隆)。



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图11




TA克隆结果(图12):



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图12




三、其他Cas9,比如Cpf1和saCas9的设计

因为以上介绍的站点没用涉及Cpf1和saCas9,特别是saCas9(非常适合AAV介导的载体基因编辑):http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html 这个网站兼容几乎所有类型的Cas9设计。


打开页面,输入要编辑区域的基因组序列,然后在PAM类型里选择你需要的Cas9类型,比如spCas9,saCas9以及cpf1等。其他条件默认设置即可,然后点击sunmit即可。非常傻瓜式的操作(图13,14)



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Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候,酶切位点一定会遭到破坏

图13




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图14