CRISPR操作指南-Cas9介导同源重组

Cas9介导同源重组（HDR）的基本操作和做基因敲除（KO）基本一致（Fig 1），除了需要多引入一条修复模板（repair template）。顺利的情况下整套操作下来至少需要4周时间（心急吃不到热豆腐嘞~~），其中单克隆的获取和鉴定是最大的限速步骤（小伙伴在这一步可以开开脑洞优化一下）。

WT的Cas9 （这里指spCas9）是引起双链断裂（DSB），进而引起NHEJ（nonhomologous end joining，意思就是断裂的末端重新连起来，这一过程容易产生indels）或者HDR（修复模板存在）；但有一个突变体（D10A）却只保留了切口酶的活性（nickase）（spCas9n），一般不会引起NHEJ，但会引起HDR（修复模板存在）。大家周知WT的spCas9会有些微的脱靶效应，因此利用cas9n代替WT的cas9产生deletion（需要两条sgRNA同时作用）或者HDR可以降低一部分脱靶的效果（Fig. 2）。

Fig 1. Cas9敲除/敲入基因时间安排(1)。

Fig 2. Cas9 (D10A)突变体（Cas9n）只保留nickase活性。

这一突变体不会引起NHJE。如果同有两条sgRNA靶向一个gene的不同位点，Cas9n会引起一个片段（两个sgRNA之间）的deletion。修复模板存在的情况下可以引起HDR(1)。

今天的内容主要讲讲利用Cas9怎么做同源重组（修复）（HDR）。其实基因的敲入（KI）也是一模一样的做法。

一、 同源臂的设计：和做KO比较，做HDR最大的不同就是要有同源模板的存在。同源模板有以下两种类型(Fig. 3):

1. 单链模板：手动设计单侧同源臂长度不低于40 nt，但强烈推荐设计~90 nt。找引物合成公司合成较长单连oligo即可(90+90+Insertion)，针对正链或者反链合成都ok。没有必要使用PAGE纯化。为了验证方便，建议引入酶切位点（RFLP法）。当然，同源模板也可以是线性化的双链DNA片段，可以通过线性化载体或者基因合成/PCR获得。溶解成终浓度10 mM，-20°C分装保存。

2. 线性化双链模板：同源臂在1000 nt左右；线性化载体或者PCR产物作为转染模板；

二、转染：

12-孔板：~2´105 cells/well (50-70% confluency)

500 ng Cas9（或者Cas9n）-sgRNA

1 ml单链同源模板（10 mM）

三、鉴定方法：

通过GFP或者puromycin富集成mixture，然后直接PCR测序或者利用Restriction-fragmentlength polymorphism (RFLP) 分析方法.

四、结论：

1.        WT的Cas9直接切割双链，引起DSB，重组效果最好，但会引起脱靶；

2.        单链oligo作为模板优于线性化载体作为模板；

3.        貌似反义 oligo的模板效果优于正链。

Fig 3. Cas9介导同源重组(1)

一、       多说几句

目前这中修复基因的方法比较适合在细胞系（包括ES细胞等）/受精卵（Zygote）中操作，因为效率还是比较高的。对于操作细胞系来说，结合单克隆挑取，往往可以获得100%的矫正。对于小鼠受精卵注射操作，也可以达到>50%的效率（被矫正的后代占全部后代的百分比）(2, 3)。已有报道AAV介导的spCas9在小鼠的脑内可以有效编辑目的基因(4)，但对于成年动物其他组织的矫正则未必能work。虽然现在有更小的Cas9-saCas9可以被包装成AAV高效特异性的导入到小鼠某个组织或者器官，但由于编辑工具的局限性整体效果往往并不理想(5, 6)；再加上同源重组的效率会进一步降低。即使如此，研究者依然可以去try，比如在新生鼠时期利用AAV-saCas9进行局部注射编辑和重组效果可能会好一些。AAV-Cas9作为目前最流行的工具组合起来使用，一定是将来几年最热门的研究热点（科维创生物提供多种血清型的高滴度AAV-sgRNA-saCas9）。将来某一天，也许会产生可以上市的AAV-Cas9基因治疗药物。