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CRISPR操作指南-Cas9介导同源重组

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Cas9介导同源重组(HDR)的基本操作和做基因敲除(KO)基本一致(Fig 1),除了需要多引入一条修复模板(repair template)。顺利的情况下整套操作下来至少需要4周时间(心急吃不到热豆腐嘞~~),其中单克隆的获取和鉴定是最大的限速步骤(小伙伴在这一步可以开开脑洞优化一下)。



WT的Cas9 (这里指spCas9)是引起双链断裂(DSB),进而引起NHEJ(nonhomologous end joining,意思就是断裂的末端重新连起来,这一过程容易产生indels)或者HDR(修复模板存在);但有一个突变体(D10A)却只保留了切口酶的活性(nickase)(spCas9n),一般不会引起NHEJ,但会引起HDR(修复模板存在)。大家周知WT的spCas9会有些微的脱靶效应,因此利用cas9n代替WT的cas9产生deletion(需要两条sgRNA同时作用)或者HDR可以降低一部分脱靶的效果(Fig. 2)。



Fig 1. Cas9敲除/敲入基因时间安排(1)。




Fig 2. Cas9 (D10A)突变体(Cas9n)只保留nickase活性。




这一突变体不会引起NHJE。如果同有两条sgRNA靶向一个gene的不同位点,Cas9n会引起一个片段(两个sgRNA之间)的deletion。修复模板存在的情况下可以引起HDR(1)。



今天的内容主要讲讲利用Cas9怎么做同源重组(修复)(HDR)。其实基因的敲入(KI)也是一模一样的做法。



一、 同源臂的设计:和做KO比较,做HDR最大的不同就是要有同源模板的存在。同源模板有以下两种类型(Fig. 3):


1. 单链模板:手动设计单侧同源臂长度不低于40 nt,但强烈推荐设计~90 nt。找引物合成公司合成较长单连oligo即可(90+90+Insertion),针对正链或者反链合成都ok。没有必要使用PAGE纯化。为了验证方便,建议引入酶切位点(RFLP法)。当然,同源模板也可以是线性化的双链DNA片段,可以通过线性化载体或者基因合成/PCR获得。溶解成终浓度10 mM,-20°C分装保存。


2. 线性化双链模板:同源臂在1000 nt左右;线性化载体或者PCR产物作为转染模板;



二、转染:


12-孔板:~2´105 cells/well (50-70% confluency)

500 ng Cas9(或者Cas9n)-sgRNA

1 ml单链同源模板(10 mM)



三、鉴定方法:


通过GFP或者puromycin富集成mixture,然后直接PCR测序或者利用Restriction-fragmentlength polymorphism (RFLP) 分析方法.



四、结论:


1.        WT的Cas9直接切割双链,引起DSB,重组效果最好,但会引起脱靶;

2.        单链oligo作为模板优于线性化载体作为模板;

3.        貌似反义 oligo的模板效果优于正链。






Fig 3. Cas9介导同源重组(1)



一、       多说几句


目前这中修复基因的方法比较适合在细胞系(包括ES细胞等)/受精卵(Zygote)中操作,因为效率还是比较高的。对于操作细胞系来说,结合单克隆挑取,往往可以获得100%的矫正。对于小鼠受精卵注射操作,也可以达到>50%的效率(被矫正的后代占全部后代的百分比)(2, 3)。已有报道AAV介导的spCas9在小鼠的脑内可以有效编辑目的基因(4),但对于成年动物其他组织的矫正则未必能work。虽然现在有更小的Cas9-saCas9可以被包装成AAV高效特异性的导入到小鼠某个组织或者器官,但由于编辑工具的局限性整体效果往往并不理想(5, 6);再加上同源重组的效率会进一步降低。即使如此,研究者依然可以去try,比如在新生鼠时期利用AAV-saCas9进行局部注射编辑和重组效果可能会好一些。AAV-Cas9作为目前最流行的工具组合起来使用,一定是将来几年最热门的研究热点(科维创生物提供多种血清型的高滴度AAV-sgRNA-saCas9)。将来某一天,也许会产生可以上市的AAV-Cas9基因治疗药物。